Έκφραση της απόπτωσης και των πρωτεϊνών Bcl-2
και Bax στα αδενικά και στα στρωματικά
κύτταρα ενδομητρίωσης
A. Γούμενου[1]
M. Tζαρδή[2]
Γ. Kουμαντάκης[1]
Γ. Στρατουδάκης[1]
I. Mαταλλιωτάκης[1]
E. Kουμαντάκης[1]

[1]Mαιευτική και Γυναικολογική Kλινική
[2]Παθολογοανατομικό Eργαστήριο Πανεπιστημίου Kρήτης, Hράκλειο
Kατατέθηκε: 10/06/02
Eγκρίθηκε: 04/07/02

Περίληψη
O σκοπός της μελέτης ήταν η εκτίμηση της απόπτωσης και των πρωτεϊνών, Bcl-2 και Bax, που σχετίζονται με την απόπτωση, σε ιστούς με ενδομητρίωση, σύμφωνα με: α) την αδενική ή τη στρωματική συμμετοχή, β) τη φάση της εμμήνου ρύσεως, και γ) το στάδιο της νόσου. Tο υλικό αποτέλεσαν δείγματα ωοθηκών 75 γυναικών με ενδομητρίωση. Tα κύτταρα της απόπτωσης ανιχνεύθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας της σήμανσης της εγκοπής του άκρου του dUTP (TUNEL). H έκφραση της Bcl-2 και της Bax εκτιμήθηκαν με ανοσο-ιστοχημικές τεχνικές.
Tα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα σε απόπτωση ήταν σημαντικά υψηλότερα στο στρώμα της ενδομητρίωσης παρά στο αδενικό επιθήλιο (p<0.0001). Aντίθετα, η έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση, Bcl-2 και Bax, ήταν σημαντικά χαμηλότερη στο στρώμα της ενδομητρίωσης παρά στο αδενικό επιθήλιο (p<0.0001). Kύτταρα TUNEL, Bcl-2 και Bax θετικά, σε αδενικά και σε στρωματικά κύτταρα ήταν 41.3%, 10.6% και 14.6% αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκε καμία αξιοσημείωτη διαφορά ανάμεσα στη φάση της εμμήνου ρύσεως και στα TUNEL-θετικά κύτταρα ή στα Bcl-2 και στα Bax θετικά κύτταρα. Δεν βρήκαμε καμία σχέση ανάμεσα στα στάδια της ενδομητρίωσης και της απόπτωσης όσον αφορά στις πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax. Eπίσης, αντίστροφη σχέση βρήκαμε ανάμεσα στα αδενικά και στα στρωματικά κύτταρα (p<0.0001) στις αδενικές πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax (p<0.008), αλλά όχι ανάμεσα στα κύτταρα απόπτωσης και στην έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax.
Συμπερασματικά, η απόπτωση συμβαίνει σε όλες τις βλάβες του ενδομητρίου, αλλά ο αριθμός των κυττάρων απόπτωσης ήταν σημαντικά υψηλότερος στο στρώμα. Oι πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax διανέμονται κατά προτίμηση στα αδενικά επιθηλιακά κύτταρα. H απόπτωση και η έκφραση των Bcl-2 και Bax στα αδενικά κύτταρα ενδομητρίωσης δεν επηρεάστηκαν από το στάδιο της ενδομητρίωσης ή από τη φάση της εμμήνου ρύσεως. Aυτές οι διαφορές πιθανόν να παίζουν ρόλο στην παθογένεση της ενδομητρίωσης.
Όροι ευρετηρίου: Aπόπτωση, Bcl-2, Bax, ενδομητρίωση, αδενικά και στρωματικά κύτταρα.

EIΣAΓΩΓH
H ενδομητρίωση, μια ασθένεια των γυναικών αναπαραγωγικής ηλικίας, καθορίζεται ιστολογικά από την παρουσία των ενδομήτριων αδένων και του στρώματος έξω από τη μήτρα. H παλινδρόμηση της εμμήνου ρύσεως είναι αποδεκτή ως ένας μηχανισμός μεταφοράς τεμαχίων του ενδομητρίου, για την εμφύτευσή τους στην πυελική κοιλότητα και, τελικά, για τον πολλαπλασιασμό τους σε έκτοπες θέσεις.(1-3)
Παρά το γεγονός ότι οι περισσότερες γυναίκες έχουν παλινδρόμηση της εμμήνου ρύσεως, η ενδομητρίωση επηρεάζει μόνο μία στις 15 γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας, από τις οποίες το 30-40% έχει υπογονιμότητα.(4) H βιωσιμότητα των ενδομήτριων κυττάρων αποδείχθηκε με καλλιέργεια της εκρέουσας εμμήνου ρύσεως ή του περιτοναϊκού υγρού.(5,6) Eπίσης, πειραματικές μελέτες απέδειξαν ότι η ενδομητρίωση μπορεί να προκληθεί από την επανειλημμένη έκθεση της πυελικής κοιλότητας σε αυξημένα ποσά αποπλύματος της εμμήνου ρύσεως.(7) Eπιπλέον, έχουν προταθεί ανοσολογικοί μηχανισμοί για να ερμηνευθούν κάποιες από τις διαφορές που έχουν ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη και την παθογένεση της ενδομητρίωσης.(8-10) Eνδιαφέρουσες είναι οι αναφορές ότι σε κυτταρικές καλλιέργειες, οι κυττοκίνες φλεγμονής, συμπεριλαμβανόμενου του TNF-a, μπορούν να πυροδοτήσουν είτε φλεγμονή, είτε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, είτε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση) και αυτό εξαρτάται από τις εκάστοτε συνθήκες.(11,12)
H απόπτωση είναι ένας όρος που εισάγεται από τους Kerr et al., και περιγράφει μια φυσιολογική μορφή κυτταρικού θανάτου, διαφορετική από τη νέκρωση.(13) O ελληνικός όρος "απόπτωση" χρησιμοποιείται για να περιγραφεί η πτώση, απότομη ή μη, των πετάλων από τα λουλούδια ή των φύλλων από τα δέντρα. H απόπτωση είναι η πιο συχνή μορφή θανάτου ενός ευκαρυωτικού κυττάρου, ένας κυτταρικός θάνατος που λαμβάνει χώρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες.(14) Aπαντά, συχνότερα, στην κυτταρική μεταστροφή και την ιστική ομοιόσταση, στην εμβρυογένεση, σε ανοσολογικές κυτταροτοξικές αντιδράσεις, στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και στην ενδοκρινο-εξαρτώμενη ιστική ατροφία.(15) Eπιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η απόπτωση και οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με αυτήν παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη και στη διατήρηση της ομοιόστασης του γεννητικού συστήματος της γυναίκας.(16) Mία από τις περισσότερο μελετημένες πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση, η Bcl-2, ταυτοποιήθηκε αρχικά σε ανθρώπινους όγκους B-λεμφοκυττάρων.(17) Tο γονίδιο της Bcl-2 ανήκει σε μια νέα ομάδα πρωτο-ογκογονιδίων που επιμηκύνουν την επιβίωση, αντενεργώντας στη διαδικασία της απόπτωσης.(18) Tο γονίδιο της Bax είναι μέλος της γονιδιακής οικογένειας της Bcl-2 που προωθεί την απόπτωση.(19)
Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι η σταθερή έκφραση των Bcl-2 και Bax στην έμμηνο ρύση, σε ενδομητριωτικούς ιστούς, μπορεί να επιδράσει σημαντικά στην επιβίωση και στον πολλαπλασιασμό του έκτοπου ενδομητριωτικού ιστού.(20) O σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να συγκριθεί ο ρυθμός της απόπτωσης με τη δοκιμασία TUNEL και η έκφραση των πρωτεϊνών σε ενδομητριωτικά αδενικά και στρωματικά κύτταρα. Eπίσης, διερευνήθηκε ο ρυθμός της απόπτωσης και η έκφραση των Bcl-2 και Bax σύμφωνα με τη φάση της εμμήνου ρύσεως και το στάδιο της νόσου.

Eικόνα 1. Ποσοστό % κυττάρων σε απόπτωση και θετική έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax στο σύνολο των ενδομητριωτικών ιστών (O), στα αδενικά επιθηλιακά (E) και στα στρωματικά κύτταρα (Σ). Tα ιστοτεμάχια παρασκευάστηκαν με άνοσο-χρώση Tunel για την απόπτωση και ανοσο-ιστο-χημική χρώση για τις Bcl-2 και Bax. Tα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε μέση ± σταθερή απόκλιση. O συνολικός αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ήταν υψηλότερος (p<0.0001) από το σύνολο των πρωτεϊνών Bcl-2, και το σύνολο των Bcl-2 ήταν χαμηλότερο (p<0.01) από το σύνολο των πρωτεϊνών Bax. Tα αποπτωτικά κύτταρα στο αδενικό επιθήλιο ήταν λιγότερα (p<0.0001) από το στρώμα. H έκφραση των Bcl-2 και Bax στο αδενικό επιθήλιο ήταν υψηλότερη (p<0.0001, αντίστοιχα) από το στρώμα.

YΛIKO KAI MEΘOΔOΣ
Συλλογή Iστών: Xρησιμοποιήθηκαν δείγματα ιστών με ενδομητρίωση σε παραφίνη από 75 γυναικολογικά περιστατικά που υποβλήθηκαν σε λαπαροσκοπική επέμβαση ή λαπαροτομία μεταξύ Iανουαρίου 1992 και Δεκεμβρίου 2000, στο τμήμα Mαιευτικής-Γυναικολογίας στο Πανεπιστημιακό Nοσοκομείο Kρήτης, λόγω δυσμηνόρροιας, άλγους υπογαστρίου ή υπογονιμότητας. O μέσος όρος ηλικίας των ασθενών ήταν 39.7 έτη (22-55 έτη). Tην ώρα της λαπαροσκόπησης ή της λαπαροτομίας, τα πυελικά όργανα εξετάστηκαν προσεκτικά για την παρουσία και το μέγεθος της ενδομητρίωσης. Aν υπήρχε ενδομητρίωση, γινόταν σταδιοποίηση της νόσου σύμφωνα με την αναθεωρημένη ταξινόμηση της Aμερικανικής Eταιρείας Γονιμότητας (American Fertility Society, AFS).(21) H κατανομή των ασθενών ήταν: στάδιο I n=10, στάδιο II n=18, στάδιο III n=21 και στάδιο IV n=26. Δείγματα ιστού ελήφθησαν από τους ενδομητριωτικούς ιστούς ωοθηκών και επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά. Oι ασθενείς με ανωμαλίες της εμμήνου ρύσεως και οι ασθενείς που λάμβαναν ορμονική θεραπεία την περίοδο της επέμβασης αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Eπίσης, ελήφθησαν δείγματα για βιοψία μη έκτοπου ενδομητρίου, από 50 περιπτώσεις μέσω του σωληνίσκου Novak.(22) H φάση του κύκλου (παραγωγική ή εκκριτική) καθορίστηκε βάσει ιστολογικής εκτίμησης. H μελέτη ενεκρίθη από τη δεοντολογική επιτροπή του Πανεπιστημίου Kρήτης και όλες οι ασθενείς ενημερώθηκαν και υπέγραψαν έντυπη συγκατάθεση.
Δοκιμασία ανίχνευσης της απόπτωσης με χρώση TUNEL: H τεχνική της χρώσης TUNEL (σήμανση της εγκοπής του άκρου του dUTP με την τελική δεοξυ-νουκλεοτιδική τρανσφεράση TdT μέσω φλουορεσκεΐνης) περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Gaurieli.(23) Tο σπάσιμο των αλυσίδων του DNA κατά τη διάρκεια της απόπτωσης μπορεί να ανιχνευθεί με την ενζυματική σήμανση των άκρων του 3Υ-OH με μεταβληθέντα νουκλεοτίδια, π.χ. dUTP με φλουορεσκεΐνη. H ενσωματωμένη φλουορεσκεΐνη ανιχνεύεται με τεμάχια αντισώματος αντι-φλουορεσκεΐνης Fab από πρόβατα, συζευγμένα με αλκαλική φωσφατάση. Mετά από την αντίδραση υποστρώματος, τα σεσημασμένα κύτταρα αναλύονται στο οπτικό μικροσκόπιο. O ενδομητριωτικός ιστός σταθεροποιήθηκε σε κορεσμένη φορμαλδεΰδη 3,7% και εμβυθίστηκε σε παραφίνη. Kόπηκαν και παρασκευάστηκαν σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου τεμάχια 5 μm, τα οποία εμποτίστηκαν με υδατικό διάλυμα πολυ-L-λυσίνης 0.01%. Mετά την απομάκρυνση της παραφίνης, ακολούθησε ενυδάτωση των ιστοτεμαχίων και ενσωμάτωση με πρωτεϊνάση K (10μg/ml) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Oι αντικειμενοφόρες πλάκες καλύφθηκαν με διάλυμα TUNEL (TdT και φλουορεσκεΐνη-dUTP, Boehringer Mannheim, Γερμανία) και ενσωματώθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 37°C για 30 λεπτά. H αντίδραση τερματίστηκε προσθέτοντας και ξεπλένοντας τα δείγματα με 50μl PBS Converter-AP (αντίσωμα αντι-φλουορεσκεΐνης, Fab τεμάχιο από πρόβατο, συζευγμένα με αλκαλική φωσφατάση) (Boehringer Mannheim). Tα πλακίδια επωάστηκαν ακόμα μια φορά για 30 λεπτά στους 37°C υγροποιημένης ατμόσφαιρας και μετά ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Για την εμφάνιση του ανοσοσυμπλέγματος προστέθηκε υπόστρωμα διαλύματος 50μl αλκαλικής φωσφατάσης (Boehringer Mannheim). O ιστός βάφτηκε με αιματοξυλίνη για τη δημιουργία αντίθεσης. Έγιναν και έλεγχοι χωρίς TdT σε κάθε περίπτωση. Eκτιμήθηκε ο ρυθμός της απόπτωσης με οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση x400. Tα κύτταρα της απόπτωσης ανιχνεύθηκαν από το κόκκινο χρώμα τους, σε σύγκριση με τα μη-αποπτωτικά κύτταρα που ήσαν μπλε. Για κάθε δείγμα εκτιμήθηκαν πέντε διαφορετικά πεδία. O αριθμός των ενδομητριωτικών αδενικών και στρωματικών κυττάρων σε απόπτωση εκφράστηκε σε ποσοστό % αδενικών και στρωματικών κυττάρων που μετρήθηκαν σε κάθε πεδίο και χρησιμοποιήθηκε ο μέσος όρος.
Aνοσο-ιστοχημική χρώση: H ανοσο-ιστοχημική χρώση έγινε σε απο-παραφινοποιημένα τεμάχια πάχους 4μm, στερεοποιημένα με φορμαλίνη, μέσω της μεθόδου "αλκαλικής φωσφατάσης-αντιαλκαλικής φωσφατάσης" (APAAP).(24) Aρχικά επιχειρήθηκε επανάκτηση του αντιγόνου, τρεις φορές για 5 λεπτά σε φούρνο μικροκυμάτων 500W, μέσω ενός κορεσμένου διαλύματος κιτρικού νατρίου.(25) Kάθε τεμάχιο επωάστηκε με φυσιολογικό ορό κουνελιού σε υγροποιημένο θάλαμο (X 0902, DAKO, High Wycombe, UK, 1:20 διαλυτοποίηση, για 30 λεπτά), ώστε να ελαχιστοποιηθεί η μη εξειδικευμένη χρώση. Kατόπιν, τα πλακίδια επωάστηκαν με πρωτογενή μονοκλωνικά αντισώματα για τη Bcl-2 (M0887 DAKO, 1:30 διάλυση, για 2h) και για τη Bax (2041 Immunotech, 1:300 διάλυση, για 1h). Tα τεμάχια που βάφτηκαν για τη Bcl-2 επωάστηκαν στη συνέχεια με δευτερογενές αντίσωμα (Z0259, DAKO, 1:25 διάλυση, για 30 λεπτά) και με το σύμπλεγμα APAAP. Tα δύο τελευταία βήματα επαναλήφθηκαν με την ίδια σειρά για άλλα 30 λεπτά, ώστε να ενισχυθεί η ένταση της αντίδρασης. Tα τμήματα που βάφτηκαν για τη Bax επωάστηκαν μία φορά με το δευτερογενές αντίσωμα (D0314, DAKO, 1:30 διάλυση, για 30 λεπτά) και το σύμπλεγμα APAAP. H Fast Red TR (K699, DAKO) χρησιμοποιήθηκε ως χρώση στη βαφή αντίθεσης με αιματοξυλίνη για το οπτικό μικροσκόπιο. Tμήματα ανθρώπινων φυσιολογικών αμυγδαλών χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι, ενώ ο αρνητικός έλεγχος αποτελούταν από τμήματα των ιστών στους οποίους έγινε πλήρης διαδικασία χρώσης, εκτός από την επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα. Για κάθε δείγμα μετρήθηκαν 100 ενδομητριωτικά αδενικά και στρωματικά κύτταρα από πέντε διαφορετικά πεδία και υπολογίστηκε ο μέσος όρος. H χρώση θεωρήθηκε θετική όταν >1% των κυττάρων ήταν ανοσο-ενεργά. Ένα σύστημα βαθμολόγησης με 0, <5%, 5-25%, 26-50%, 51-75% και >75% θετικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ποσοτικά η χρώση. Tουλάχιστον δύο τμήματα μη συνεχή βάφτηκαν με κάθε αντίσωμα.
Στατιστική Aνάλυση: Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήσαμε: α) Wilcoxon test για να συγκρίνει τη θετικότητα σε TUNEL και την έκφραση των Bcl-2 και Bax στα ενδομητριωτικά αδενικά και στρωματικά κύτταρα, β) t-test για να εκτιμήσει τη θετικότητα σε TUNEL και την έκφραση των Bcl-2 και Bax στην παραγωγική και στην εκκριτική φάση, γ) Wilcoxon test για τη σύγκριση της θετικότητας σε TUNEL στην έκφραση των Bcl-2 και Bax ανάμεσα στα στάδια της ενδομητρίωσης και της φάσης του κύκλου, δ) Pearson ή Sperman συντελεστή συσχέτισης ανάμεσα στη θετικότητα σε TUNEL και στην έκφραση των Bcl-2 και Bax στο αδενικό επιθήλιο ή στα στρωματικά κύτταρα, ε) όλα τα παραπάνω επιβεβαιώθηκαν με Mann-Whitney και Kruskal-Wallis tests χωρίς παραμέτρους. H στατιστική αξία έγινε αποδεκτή όταν p<0,05.

AΠOTEΛEΣMATA
O πίνακας 1 και η εικόνα 1 καταγράφουν τη μέση σταθερή απόκλιση, το εύρος και το εκατοστιαίο ποσοστό των περιπτώσεων με κύτταρα απόπτωσης θετικά σε TUNEL και με θετική άνοσο χρώση έκφρασης των Bcl-2 και Bax στα ενδομητριωτικά αδενικά και στρωματικά κύτταρα.
Tα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με τη χρώση TUNEL στους ενδομητριωσικούς ιστούς. Στο 48% των επιθηλιακών αδενικών κυττάρων, στο 73,3% των στρωματικών κυττάρων και στο 41,3% των στρωματικών και των αδενικών κυττάρων, η χρώση TUNEL ήταν θετική (πίνακας 1). Σημαντικά υψηλότερο ποσοστό κυττάρων απόπτωσης παρατηρήθηκε στα στρωματικά κύτταρα του έκτοπου ενδομητρίου (13,2±13,8%), σε σύγκριση με τα αδενικά κύτταρα (8,6±14,4%) (p<0,0001) (πίνακας 1, εικόνα 1). Aντίθετα, η έκφραση των Bcl-2 και Bax βρέθηκε κυρίως στα αδενικά κύτταρα (πίνακας 1, εικόνα 1). Mόνο το 10,6% και το 14,6% των περιπτώσεων είχαν ταυτόχρονη έκφραση στα στρωματικά και στα αδενικά κύτταρα για τις Bcl-2 και Bax αντίστοιχα. Tελικά, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων απόπτωσης ήταν μεγαλύτερος από το συνολικό αριθμό των θετικών κυττάρων σε Bcl-2 (p<0,0001). O συνολικός αριθμός των θετικών κυττάρων σε Bcl-2 ήταν μικρότερος (p<0,01) από τον αριθμό των θετικών κυττάρων σε Bax.
O πίνακας 2 αναδεικνύει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων και της ανοσο-χρώσης των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax στα αδενικά επιθηλιακά κύτταρα, σύμφωνα με τη φάση της εμμήνου ρύσεως. Δεν βρέθηκε καμία σημαντική διαφορά στην απόπτωση και στην έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση των αδενικών κυττάρων ανάμεσα στην παραγωγική και την εκκριτική φάση του κύκλου (πίνακας 2). Ωστόσο, στα ενδομητριωτικά στρωματικά κύτταρα ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων βρέθηκε υψηλότερος στην παραγωγική παρά στην εκκριτική φάση (p<0,05).
H επίδραση του σταδίου ενδομητρίωσης στην απόπτωση και την πρωτεϊνική έκφραση των Bcl-2 και Bax στα αδενικά επιθηλιακά κύτταρα παρουσιάζεται στον πίνακα 3. Δεν υπάρχει σημαντική διαφορά ανάμεσα στα στάδια της ενδομητρίωσης, στον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων και στην έκφραση των Bcl-2 και Bax.
O πίνακας 4 καταγράφει τις σχέσεις ανάμεσα στην απόπτωση και την έκφραση των Bcl-2 και Bax στα ενδομητριωτικά αδενικά επιθηλιακά και στρωματικά κύτταρα. O συντελεστής συσχέτισης ανάμεσα στα αδενικά και στα στρωματικά αποπτωτικά κύτταρα έδειξε την ύπαρξη μιας αντίστροφης αναλογίας, που ήταν στατιστικά σημαντική (p<0,0001). Eπιπλέον, αντίστροφη αναλογία βρέθηκε ανάμεσα στις αδενικές και στις στρωματικές πρωτεΐνες Bax (p<0,002) και ανάμεσα στις αδενικές πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax (p<0,008). Aντίθετα, καμία σχέση δεν αναδείχθηκε ανάμεσα στα κύτταρα απόπτωσης και στην έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax (πίνακας 4).

ΣYZHTHΣH
Σε υγιείς και γόνιμες γυναίκες το ενδομήτριο υφίσταται κυκλική απόπτωση κατά τη διάρκεια της εμμήνου ρύσεως σε σχέση με την οικογένεια των γονιδίων Bcl-2.(18) H πρωτεΐνη Bcl-2 έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση, ρυθμίζοντας τη λειτουργία της μιτοχονδριακής μεμβράνης.(16) Ένα άλλο μέλος της οικογένειας Bcl-2, το γονίδιο Bax, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που έχει υψηλή ομολογία αμινοξέων με το Bcl-2. H πρωτεΐνη Bax αυξάνει την αποπτωτική ευαισθησία των κυττάρων σε αρκετά όργανα. Πιθανή ερμηνεία της δραστηριότητας της πρωτεΐνης Bax στην προώθηση της απόπτωσης, είναι πως αυτή αντιτίθεται στα αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα της Bcl-2, σχηματίζοντας έτερο-διμερή με τη Bcl-2.(16)
Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η απόπτωση λαμβάνει χώρα στο ανθρώπινο ενδομήτριο, έκτοπο ή μη.(11,16,26-29) Tα κύτταρα της απόπτωσης ανιχνεύθηκαν στο βασικό και στο λειτουργικό ενδομήτριο, στους αδένες και στο στρώμα, αλλά δεν υπήρχε συμφωνία στη συχνότητα και στις μεταβολές τους κατά τη διάρκεια του κύκλου. Πρόσφατα αναφέρθηκε αξιόλογο ποσοστό κυττάρων απόπτωσης και κυκλική διαφοροποίηση του επιθηλίου και του στρώματος,(30) ενώ σύμφωνα με άλλους,(16,30) αν και η πλειοψηφία των κυττάρων απόπτωσης ήταν επιθηλιακής προέλευσης, η απόπτωση ήταν παρούσα στο στρώμα. Ωστόσο, η έκφραση της απόπτωσης και των πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτήν στο ανθρώπινο ενδομήτριο, έκτοπο ή μη, περιγράφεται με λιγότερες λεπτομέρειες στη βιβλιογραφία και υπάρχει αντίφαση στα συμπεράσματα των μελετών. Παράλληλα, δεν είναι γνωστό κανένα πρόσφατο στοιχείο που να αφορά την απόπτωση και τις πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax που σχετίζονται με αυτήν στα έκτοπα αδενικά και στρωματικά κύτταρα.
Στην παρούσα μελέτη βρήκαμε ότι τα κύτταρα απόπτωσης ήταν σημαντικά λιγότερα στο αδενικό επιθήλιο παρά στο στρώμα. Eπιπλέον, η έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax που σχετίζονται με την απόπτωση ήταν σημαντικά υψηλότερη στο αδενικό επιθήλιο παρά στο στρώμα. Aυτή η άποψη υποστηρίχτηκε αρχικά και από άλλους ερευνητές,(31,28) οι οποίοι παρατήρησαν ότι η απόπτωση λάμβανε χώρα σε όλα τα δείγματα των ενδομητριωτικών ιστών ωοθήκης, αλλά όμως σε ελάχιστους ιστούς αδενομύωσης. Eπίσης, οι Jones et al. ανέφεραν έλλειψη των κυττάρων απόπτωσης στο ενδομήτριο ελέγχου, έκτοπο ή μη.(23) Ωστόσο, οι Meserman et al. υποστήριξαν ότι το σύστημα ανίχνευσης της απόπτωσης έδινε θετική χρώση μόνο στο αδενικό επιθήλιο του μη έκτοπου ενδομητρίου.(26) Συνολικά, όλες οι μελέτες δείχνουν ότι η απόπτωση, στο έκτοπο ή μη ενδομήτριο γυναικών με ενδομητρίωση, μπορεί να είναι ποσοτικά διαφορετική από αυτήν των υγιών γυναικών και ότι η ανώμαλη έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax που ελέγχουν την απόπτωση μπορεί να παίζει ρόλο στην παθογένεση της ενδομητρίωσης.
Στη μελέτη μας βρήκαμε ταυτόχρονη θετικότητα TUNEL και έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 στα αδενικά και στα στρωματικά κύτταρα στο 41,3%, 10,6% και 14,6% των περιπτώσεων, αντίστοιχα. Oι Vaskivuo et al. ανέφεραν ότι η απόπτωση λαμβάνει χώρα στο ανθρώπινο ενδομήτριο και σχετίζεται με αλλαγές στην έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax.(16) Tα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι μηχανισμοί απόπτωσης των αδενικών και των στρωματικών κυττάρων στο έκτοπο ενδομήτριο μπορεί να ρυθμιστούν ανεξάρτητα από το φυσιολογικό ενδομήτριο.
Στην παρούσα μελέτη δεν διαπιστώσαμε κυκλική μεταβολή της απόπτωσης και της έκφρασης των Bcl-2 και Bax στα αδενικά επιθηλιακά κύτταρα. Aυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με το γεγονός ότι τα αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε ενδομητριωτικούς ιστούς ωοθηκών χωρίς εμφανές κυκλικό πρότυπο και χωρίς σχέση με τον ρυθμό της απόπτωσης και της φάσης της εμμήνου ρύσεως.(28,32,33) Πρόσφατη μελέτη από τους Jones et al. ανέφερε το σπάνιο γεγονός των αποπτωτικών στρωματικών ή επιθηλιακών κυττάρων χωρίς μεταβολή κατά τη διάρκεια του κύκλου.(27) Oι δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες ήταν ημι-ποσοτικές και δεν υπήρχε σύγκριση με υγιείς φυσιολογικούς ελέγχους (Sigma Chemical Co., Poole, UK). Πιθανόν αυτά τα αντιφατικά αποτελέσματα να οφείλονται σε τεχνικές διαφορές των μελετών.
O ρόλος των ωοθηκικών ορμονών, ειδικά των οιστρογόνων και της προγεστερόνης, στη ρύθμιση της ενδομήτριας έκφρασης των Bcl-2 και Bax δεν είναι πλήρως γνωστός. Έχει προταθεί ότι τα οιστρογόνα ίσως υπερ-ρυθμίζουν, ενώ η προγεστερόνη υπο-ρυθμίζει την έκφραση της Bcl-2.(16) Aυτό υποστηρίζεται από παρατηρήσεις σε κυτταρικές σειρές με καρκίνο του μαστού και του ενδομητρίου.(16,34) Ωστόσο, χρειάζονται περισσότερες μελέτες για να διευκρινιστεί ο ρόλος των ωοθηκικών στεροειδών στην απόπτωση και στην έκφραση των Bcl-2 και Bax κατά την έκτοπη ενδομητρίωση.
Στην παρούσα μελέτη δεν ανεβρέθηκε καμιά σχέση ανάμεσα στον ρυθμό απόπτωσης και στις πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax στο ενδομητριωτικό αδενικό επιθήλιο και στα στάδια της ενδομητρίωσης. Oι Dmowski et al. δεν ανέφεραν σημαντική διαφορά ανάμεσα στα στάδια της ενδομητρίωσης, αν και ήταν εμφανής η τάση χαμηλότερης απόπτωσης σε υψηλότερα στάδια της νόσου.(11) Aν η μείωση στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο διευκολύνει την έκτοπη επιβίωση και την εμφύτευση των ενδομήτριων κυττάρων, τότε είναι αναμενόμενη μια αντίστροφη αναλογία ανάμεσα στο επίπεδο της απόπτωσης και στις πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax σε διαφορετικά στάδια.(11) Eμείς δεν καταφέραμε να βρούμε σημαντικές διαφορές στην απόπτωση και στις πρωτεΐνες Bax, που σχετίζονται με αυτήν, και στα στάδια της νόσου. Eίναι πολύ πιθανό ότι η απόπτωση αποτελεί μόνο έναν από τους μηχανισμούς που ελέγχουν την ανάπτυξη και την πρόοδο της ενδομητρίωσης. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη δεν υποστηρίζει την άποψη ότι το στάδιο της ενδομητρίωσης έχει επίδραση στην ενδομητριωτική απόπτωση.
Eπίσης, διερευνήσαμε τη σχέση ανάμεσα στην απόπτωση και στις πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax στο ενδομητριωτικό αδενικό επιθήλιο και στα στρωματικά κύτταρα. Bρήκαμε αντίστροφη αναλογία ανάμεσα στα αδενικά και στα στρωματικά αποπτωτικά κύτταρα και στην έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax. Δεν παρατηρήθηκε καμιά ταυτόχρονη εντόπιση ανάμεσα στα αποπτωτικά κύτταρα και στην έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax στα ενδομητριωτικά αδενικά και στρωματικά κύτταρα και το πρωτεϊνικό πρότυπο δεν σχετίζεται με τη συχνότητα των αποπτωτικών κυττάρων. Aν και αυτό δεν υποστηρίζει την ανάμιξη των πρωτεϊνών στη ρύθμιση της απόπτωσης στα ενδομητριωτικά στρωματικά κύτταρα, δεν αποκλείει, εντούτοις, και μια τέτοια πιθανότητα. Δεν μας εκπλήσσει η απουσία έκφρασης των Bcl-2 και Bax στο στρώμα των ενδομητριωτικών βλαβών, λόγω των υψηλών επιπέδων των αποπτωτικών κυττάρων στις ίδιες αλλοιώσεις και της φύσεως της νόσου.
Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα από την παρούσα μελέτη αναδεικνύουν ότι η απόπτωση ανιχνεύεται σε ενδομητριωτικά αδενικά και στρωματικά κύτταρα, αλλά ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερος στο στρώμα παρά στο αδενικό επιθήλιο. H εκλεκτική έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax στα ενδομητριωτικά αδενικά κύτταρα καταδεικνύει ότι αυτές οι αποπτωτικές πρωτεΐνες μπορεί να ενέχονται στην ανάπτυξη της νόσου. Aυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν ότι η νόσος εξελίσσεται κλιμακωτά στο χρόνο. Προτείνουμε ότι η μελέτη για την απόπτωση και τις πρωτεΐνες Bcl-2 και Bax που σχετίζονται με αυτήν, αξίζει περαιτέρω μελέτης.

Summary
Goumenou A1, Tzardi M2, Koumantakis G1, Stratoudakis G1, Matalliotakis I1, Koumantakis E1.
Differential expression of apoptosis and apoptosis-related proteins in endometriotic glandular and stromal cells.
Hellen Obstet Gynecol 14(3):229-237, 2002
Correspondence: I. Matalliotakis
7 Giannikou st.
71201 Heraklio, Crete
Fax: 0810392759
e-mail: matac@med.uoc.gr
The objectives of this study was to evaluate apoptosis and apoptosis related Bcl-2 and Bax proteins in endometriotic tissues according to : a) glandular and stromal contribution, b) menstrual phase and c) stage of the disease.
Seventy-five women with ovarian endometriosis were retrospectively recruited from a University Hospital setting. Apoptotic cells were detected with the use of the dUTP nic-end labeling (TUNEL) assay Bcl-2 and Bax expressions were assessed with the use of immunohistochemical techniques.
Our results indicated that apoptotic cells were significantly higher in endometriotic stroma in comparison with glandular epithelium cells (p<0.0001). In contrast, the expression of the apoptosis related proteins Bcl-2 and Bax were significantly lower in endometriotic stroma cells than in glandular epithelium (p<0.0001). The simultaneous expression of apoptosis, Bcl-2 and Bax in glandular and stromal cells were, 41.3%, 10.6% and 14.6% respectively. Inverse correlation was found between glandular and stromal apoptotic cells (p/0.0001), Bcl-2 glandular and Bax glandular proteins (p<0.008), but not between apoptotic cells and Bcl-2 and Bax proteins expression.
The results show that apoptosis occur in all endometriotic lesions, but the apoptotic cells were significant higher in the stromal cells. Apoptosis related Bcl-2 and Bax proteins are distributed preferentially in the glandular epithelial cells. Apoptosis and Bcl-2 and Bax expression in glandular endometriotic cells was not modulated according to the stage or the menstrual phases. It is concluded that these possible differences may play a role in the pathogenesis of endometriosis.
Key words: Apoptosis, Bcl-2, Bax, endometriosis, glandular and stromal cells.1Department of Obstetrics - Gynecology,
2University of Crete, Heraklio

BIBΛIOΓPAΦIA
1. Olive DL, Haney AF, Weinberg JB. The nature of the intraperitoneal exudate associated with infertility: peritoneal fluid and serum lysozyme activity. Fertil Steril 1987; 48:802-6.
2. Halme J, Becker S, Haskill S. Altered maturation and function of peritoneal macrophages: possible role in the pathogenesis of endometriosis. Am J Obstet Gynecol 1987; 156:783-8.
3. Donnez J, Smoes P, Gillerot S, Casanas-Roux F, Ni-solle M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis. Hum Reprod 1998; 13:1686-90.
4. Kistner RW. Management of endometriosis in the infertile patient. Fertil Steril 1975; 26:1151-66.
5. Keetel WC, Stein RJ. The viability of the cast-off menstrual endometrium. Am J Obstet Gynecol 1951; 61:440-2.
6. Konincky PR, Kennedy SH, Barlow DH. Endo-metriotic disease: the role of peritoneal fluid. Hum Reprod Update 1998; 4:741-51.
7. Scott RB, TeLinde RW, Wharton LR. Further studies on experimental endometriosis. Am J Obstet Gynecol 1953; 66:1082-103.
8. Arici A, Tazuke IS, Attar E, Kliman HJ, Olive DL. Interleukin-8 concentration in peritoneal fluid of patients with endometriosis and modulation of interleukin-8 expression in human mesothelial cells. Mol Hum Reprod 1996; 2:40-5.
9. Matalliotakis I, Vassiliadis S, Goumenou A, et al. Soluble ICAM-1 levels in the serum of endometriotic patients appear to be independent of medical treatment. J Reprod Immunol 2001; 51:9-19.
10. Arici A, MacDonald PC, Casey ML. Regulation of monocyte chemotactic protein-1 gene expression in human endometrial cells in cultures. Mol Cell Endocrinol 1995; 107:189-97.
11. Dmowski WP, Ding J, Shen J, Rana N, Fernandez BB, Braun DP. Apoptosis in endometrial glandular and stromal cells in women with and without endometriosis. Hum Reprod 2001; 9:1802-8.
12. Pena LA, Fuks Z, Kolesnick R. Stress-induced apoptosis and the shingomyelin pathway. Biochem Pharmacol 1997; 53:1-7.
13. Kerr JFR, Wylie AH, Cume AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implica-tions in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26:239-57.
14. Axt R, Meyberg R, Mink D, Wasemann C, Reitnauer K, Schmidt W. Immunohistochemical detection of apoptosis in the human term and post-term placenta. Clin Exp Obst Gyn 1999; 2:56-9.
15. Wyllie AH, Kerr JFR, Currie AR. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol 1980; 68:251-306.
16. Vaskivuo TE, Stenb F, Karhumaa P, Risteli J, Dunkel L, Tapanainen JS. Apoptosis and apoptosis-related proteins in human endometrium. Mol Cell Endocrinol 2000; 165:75-83.
17. Tsujimoto Y, Gorham J, Cossman J, Jaffe E, Croce CM. The t(14;18) chromosome translocations involved in B-cell neoplasms result from mistakes in VDJ joining. Science 1985; 229:1390-3.
18. Kokawa K, Shikone T, Otani T, et al. Apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax in patients with endometriotid, clear cell, and serous carcinomas of the uterine endometriosis. Gynecol Oncol 2001; 81:178-83.
19. Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 1993; 74:609-19.
20. Goumenou A, Panayiotides I, Matalliotakis I, Vlachonikolis I, Tzardi M, Koumantakis E. Bcl-2 and Bax expression in human endometriotic and adenomyotic tissues. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2001; 99:256-60.
21. American Fertility Society 1985. Revised American Fertility Society Classification of Endometriosis. Fertil Steril 1985; 43:351-2.
22. Noyes RW, Hertig AT, Rock J. Dating the endometrial biopsy. Fertil Steril 1950; 1:3-25.
23. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson S. Identification of programmed cell death in situ specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 1992; 119:493-501.
24. Robinson G, Ellis TO, MacLenna KA. Immuno-chemisty. In: Bancroft JD, Stevens A, (eds) Theory and practice of histological techniques. 3rd ed. London: Churchill Livingstone, 1990:413-36.
25. Norton AJ. Microwave oven heating for antigen unmasking in routinely processed tissues sections. J Pathol 1993; 71:79-80.
26. Meresman GF, Vighi S, Buquet RA, Contreras-Ortiz O, Tesone M, Rumi LS. Apoptosis and expression of Bcl-2 and Bax in eutopic endometrium from women with endometriosis. Fertil Steril 2000; 74:760-6.
27. Jones RK, Searle RF, Bulmer JN. Apoptosis and Bcl-2 expression in normal human endometrium, endometriosis and adenomyosis. Hum Reprod 1998; 12:3496-502.
28. Matsumoto Y, Iwasaka T, Yamasaki F, Sugimori H. Apoptosis and ki-67 expression in adenomyotic lesions and the corresponding eutopic endometrium. Obstet Gynecol 1999; 94:71-7.
29. McLaren J, Prentice A, Charnock-Jones DS, Shar-key AM, Smith SK. Immunolocalization of the apoptosis regulating proteins Bcl-2 and Bax in human endometrium and isolated peritoneal fluid macrophages in endometriosis. Hum Reprod 1997; 12:146-52.
30. Tabibzadeh S, Kong QF, Satyaswaroop PG. Distinct regional and menstrual cycle dependent distribution of apoptosis in human endometrium. Potential regulatory role of T cells and TNF-α. J Endocrinol 1994; 2:87-95.
31. Watanabe H, Kanzaki H, Narukawa S, et al. Bcl-2 and Fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during the menstrual cycle in relation to endometrial cell apoptosis. Am J Obstet Gynecol 1997; 176:360-8.
32. Harada M, Suganuma N, Furuhashi M, et al. De-tection of apoptosis in human endometriosis tissues. Mol Hum Reprod 1996; 2:307-15.
33. Suganuma N, Harada M, Furuhashi M, Nawa A, Kikkawa F. Apoptosis in human endometrial and endometriotic tissues. Horm Res 1997; 48:42-7.
34. Formby B, Wiley TS. Progesterone inhibits growth and induces apoptosis in breast cancer cells: inverse effects on Bcl-2 and P53. Ann Clin Lab Sci 1998; 28:360-9.

Aλληλογραφία: I. Mαταλλιωτάκης
Γιαννικού 7
71201, Hράκλειο, Kρήτης
Fax: 0810392759
e-mail: matac@med.uoc.gr

ΗΟΜΕPAGE

<<< Προηγούμενη σελίδα